摘要:

        目的　研究板蓝根饮片HPLC指纹图谱。

        方法　应用RP-HPLC法,梯度洗脱分析市售的11批板蓝根饮片的醋酸乙酯提取物,建立板蓝根饮片的指纹图谱。结果　不同来源的板蓝根饮片的醋酸乙酯提取物的色谱图相近,特征共有峰12个,相对峰面积相差很大。结论　建立的方法用于板蓝根药材的鉴别和质量评价简便、准确,为深入研究板蓝根的质量标准提供了实验基础。

　　关键词:板蓝根;高效液相;指纹图谱

　　板蓝根(Radix Isatidis)系十字花科植物菘蓝( Isatis in-digotica Fort. )的干燥根,性寒味苦,具有清热解毒、凉血消炎的功效。作为一味传统中药,其应用相当广泛,临床上多用于治疗流感、肝炎、腮腺炎、流脑、扁桃体等病毒性、细菌性疾病。现代药理已经明确了其在抗细菌内毒素[ 1, 2 ]、抗炎抑菌[ 3 ]、抗病毒[ 4, 5 ]等方面作用,而在质量控制方面,无论是药材还是制剂,到目前为止,仍用靛玉红、靛蓝作为含量测定的指标,而靛玉红和靛蓝本身并没有上述功能,因此,对于板蓝根药材质量标准,用单一靛玉红或靛蓝含量作为指标,不能全面反映药材的质量。本实验采用了RP-HPLC法,对于购于2003年10～11月份的11批板蓝根饮片的醋酸乙酯提取物进行了指纹图谱研究,为深入研究板蓝根的质量标准提供了实验基础。

　　1　实验材料

　　1. 1　样品

　　11批样品来源见表1。上述药材饮片经浙江大学药学院中药与天然药物研究室陈柳蓉副教授鉴定为十字花科植物菘蓝( Isatis indigotica Fort. )的根。

　　1. 2　仪器及试剂

　　Agilent 1100液相色谱仪, DAD和VWD 检测器;MettlerToledo AG135双量程电子天平(精度万分之一和十万分之一) ;中性氧化铝(上海五四试剂厂) ; 甲醇(美国Merck公司,色谱纯) ,双蒸水,醋酸乙酯(分析纯) ;靛玉红对照品(中国药品生物制品检定所) ,批号0717-200003。

　　2　实验方法

　　2. 1　色谱条件和系统适应性实验

　　色谱柱ZORBAX XDB C18 (4. 6mm ×250mm, 5μm) ODS柱,检测波长290nm, 柱温30℃, 流动相甲醇-水(梯度洗脱) ,流速0. 8mL /min,进样量5μL,所有组分均在60min内被检测完。靛玉红标准品的理论塔板数在1万以上。

　　2. 2　供试液制备

　　精密称取40℃真空干燥的80 目板蓝根粉末5g, 置250mL圆底烧瓶中,加入50mL 醋酸乙酯,回流提取2 h,抽滤,再用50mL醋酸乙酯分5次洗涤滤渣和瓶壁,合并滤液,减压浓缩至1mL,加于已经处理好的中性氧化铝柱(4g氧化铝,醋酸乙酯湿法装柱) ,用25mL 醋酸乙酯洗脱,将洗脱液合并浓缩,定容至5mL,过0. 45μm滤膜,备用。

　　2. 3　对照品溶液的制备

　　取靛玉红对照品,精密称定2. 10mg,用分析纯醋酸乙酯定容至10mL,过0. 45μm滤膜,备用。

　　2. 4　方法学考察

　　2. 4. 1　精密度考察　取1号供试液,连续进样6次,记录图谱, 11号峰(靛玉红)相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0. 13%和1. 93% ,其他11个共有峰的相对保留时间的RSD为0. 03% ～0. 21% ,相对峰面积的RSD 为1. 82% ～3. 23% ,表明精密度良好。

　　2. 4. 2　板蓝根HPLC指纹图谱的重现性　取1号板蓝根粉末6份,精密称定,按照2. 2方法制备供试液,分别进样,记录图谱, 11号峰(靛玉红)相对保留时间和相对峰面积的RSD为0. 18%和2. 43% ,其他11个共有峰的相对保留时间的RSD为0. 05%～0. 61% ,相对峰面积的RSD为2. 38%～4. 68%。

　　2. 4. 3　板蓝根HPLC指纹图谱的稳定性试验　取1号供试液,在0, 3, 6, 9, 12, 18h进样,记录图谱,在12h内,测定11号峰(靛玉红)相对峰面积的RSD为3. 15% ,其他11个共有峰的相对峰面积的RSD为0. 86% ～3. 28% ,表明样品溶液在12h内稳定。18h进样,发现10号峰面积明显降低。

　　3　指纹图谱及各项技术参数

　　3. 1　共有峰的指定

　　根据11批供试品溶液的HPLC谱提供的相关参数,比较各批样品的色谱图,其中共有峰12个,见图1;第11号峰为靛玉红,见图2; 11批不同来源样品叠加的色谱图见图3。

　　3. 2　共有峰的相对保留时间、相对峰面积4号峰在11批样品中都是主峰,且稳定,所以定4号峰为参照峰。共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别见表2,表3。

　　3. 3　不同来源的板蓝根的比较

　　从不同来源板蓝根饮片的保留时间来看,其含有的成分相似,但是从共有峰的相对面积和绝对面积(表1和图3)来看,这些共有成分在量上相差很大,由此可以看出内在质量的差异。因此要控制板蓝根制剂的质量,建议固定药材来源。

　　3. 4　不同性状板蓝根谱图差异

　　3. 4. 1　在共有峰相同情况下,不同大小板蓝根在谱图上的差异:饮片直径较大的(表1中直径0. 2～0. 6, 0. 3～0. 8, 0. 5～1. 0cm) ,其1号峰的相对面积较低,在0. 55以下;若饮片直径较小的(表1中直径0. 1～0. 3, 0. 1～0. 4, 0. 2～0. 4cm) ,其1号峰的相对面积都在0. 95以上,最高的达到7. 07。

　　3. 4. 2　在共有峰相同情况下不同色泽板蓝根在成分上的差异:颜色深(土褐色)的板蓝根饮片,其6号峰的相对面积大于7号峰的相对峰面积,而颜色浅(土黄和粉白)的板蓝根饮片,其6号峰的峰面积小于7号峰的相对峰面积。

　　4　讨论

　　4. 1　本实验对不同的提取溶剂(甲醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿) 、不同提取方法(超声、回流)进行了考察,确定了以上供试品的制备方法。用醋酸乙酯回流提取,过中性氧化铝柱除杂,得到的化学信息充分且基线稳定。

　　4. 2　采用DAD对检测波长进行选择,在290nm波长下,信息量充分, 且吸收强度大。在用DAD 选定波长后, 采用VWD检测。

　　4. 3　按照本法,用简单梯度洗脱,能将板蓝根中小极性成分很好的分离,这为板蓝根药材和制剂,特别是注射剂制定指纹图谱提供了实验依据。

　　4. 4　实验过程中发现,样品在放置18h后10 号峰面积降低,其前面的9号峰明显增加。11号峰面积略有降低。放置24h后进样, 10号峰和11号峰都明显下降,其最终降解成何物质,有待于在以后的研究中确定。

　　4. 5　在本实验中,我们发现不同外观(色泽和大小)的药材饮片在HPLC谱图上有些规律性差异(见“3. 4”项下) ,若要得到确切的结果,需要收集更多来源确切的样品,进行深入研究验证。本实验得到的指纹图谱基本反映了板蓝根饮片醋酸乙酯提取部分的化学信息,而其谱图信息和药理作用的相关性,需要进一步深入研究。

　　参考文献

　　[ 1 ] 刘云海, 林剑国, 雷婷. 板蓝根有效部位对脂多糖致小鼠血清中TNFα和NO的影响[ J ]. 中草药, 2003, 34 (2) : 152.

　　[ 2 ] 林爱华, 方淑贤, 方建国,等. 板蓝根F022部位抗内毒素活性研究[ J ]. 中国中药杂志, 2002, 27 (6) : 439.

　　[ 3 ] 汤杰, 施春阳, 徐晗,等. 板蓝根抑菌抗炎活性部位的评价[ J ]. 中国医院药学杂志, 2003, 23 (6) : 327.

　　[ 4 ] 刘思贞, 祝希娴, 邵玉芹,等. 板蓝根抗流感病毒有效部位的筛选[ J ]. 中草药, 1999, 30 (9) : 650.

　　[ 5 ] 朱理安, 关瑞锦, 胡锡衷. 板蓝根对实验性病毒性心肌炎心肌细胞的保护作用研究[ J ]. 中华心血管病杂志, 1999, 27(6) : 467.

　　作者:林文艳 ,莫建霞 ,于荣敏 ,周长新 ,赵昱

　　摘自:中国现代应用药学杂志